Rutin Sperm Analizi
-Hastadan tek yada iki ayrı kapta (split)1 alınan ejekülat(semen) örneği 15-30 dakika kadar (likefaksiyon süresi; alınan örneğin incelenebilmesi için gereken sıvılaşma süresi) 37C sıcaklıktaki bir dolap(etüv) içerisinde bekletilir. Daha sonra örnekteki sperm sayısı, hareketliliği ve morfolojik (şekilsel) özellikleri değerlendirilir.
-Değerlendirmeden sonra, semen örneği yıkama işlemine sokulur. İki aşamadan oluşan bu işlem yaklaşık olarak 35-40 dakika sürmektedir. (İşlemin amacı hastadan alınan semen örneğindeki sperm hücrelerini, diğer seminal plazma hücrelerden(döküntü hücrelerden) arındırmak ve sperm hareketlerinin arttırılarak döllemeye hazır hale getirmektir.)
Aşılama
-Yıkama işlemini takiben, hazırlanan örnek, sperm hareketlerini arttırmak amacıyla 37C sıcaklık ve %6 CO2(karbondioksit-yapay vücut ortamına benzer ortam) içeren özel dolaplar (inkübatörler) içinde 30 dakika kadar bekletilir. Bu sürenin sonunda spermler bir enjektör aracılığıyla kadının rahmine enjekte edilir. Bu işlem sayesinde spermlerin katetmesi gereken yol kısaltılmış olur.
-Aşılamada gebelik oranları çiftin kısırlık sebebine, kadının yaşına, stimülasyon protokolü (ilaç tedavisi) neticesinde meydana gelen folikül(yumurtanın içerisinde geliştiği hücreler) sayısına ve sperm parametrelerine bağlı olarak %15-25 arasında değişkenlik göstermektedir.
Tüp bebek-Mikroenjeksiyon
Hastaya mikroenjeksiyon ya da tüp bebek uygulamasının kararı infertilite(kısırlık) sebebine, toplanan oosit (yumurta) sayısına ve sperm özelliklerine bağlı olarak belirlenir. Tüp bebek ve mikroenjeksiyon uygulamalarında hasta açısından uygulanması gereken prosedürler benzer olmakla birlikte IVF laboratuarında yapılan işlemler farklılık göstermektedir. Tüp bebekte anne adayından alınan yumurtalarla baba adayından alınan spermler özel bir kültür sıvısına birlikte koyularak inkübatör adı verilen özel dolaplarda 14-16 saat civarı bekletilir ve bu süre sonucunda sperm hücrelerinin yumurtaları döllemeleri beklenir. Mikroenjeksiyonda ise tüp bebekten farklı olarak her bir yumurtanın içerisine tek bir sperm hücresi mekanik olarak yerleştirilir. Böylece spermin yapacağı göreve mikromanüplatör denilen aletler yardımcı olur. Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğunluğu tüp bebek vemikroenjeksiyon sonrasında benzer gebelik ve implantasyon (transfer edilen embriyo başına ana rahmine tutunabilen embriyo sayısı) oranlarının elde edilebildiğini göstermiştir.
Tüp Bebek
-Yumurta toplama işleminden sonra yumurtalar özel kültür solüsyonları içerisinde 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren özel inkübatörlerde matürasyonlarını (olgunlaşma) tamamlamak için 3-5 saat kadar inkübe edilir.
-Bu süreçte semen örneği yıkanır ve işleme hazır hale getirilir ve dölleme işlemi yapılana kadar 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.
-Süre sonunda, hazırlanan sperm örneğinden; sayı ve hareketliliğe bağlı olarak belirlenen bir konsantrasyonda oositlerin (yumurtaların) kültüre edildiği ortama bırakılır ve 14-16 saat civarı döllenme işleminin gerçekleşmesi için 37C sıcaklık ve %6CO2 li ortamda inkübe edilir.
-Bir gün sonrasında yumurtalar çevrelerindeki hücrelerden arındırılarak döllenme kontrolü yapılır. Yumurta içerisinde dişi ve erkek çekirdeğinin gözlenmesi döllenmenin göstergesidir.
Mikroenjeksiyon
-Yumurta toplama işlemi sonrasında oositler kültür solüsyonları içerisinde mastürbasyonlarını tamamlamaları için 2-3 saat 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.
-Bu süre içerisinde semen örneği hazırlanır.
-Süre sonunda yumurta çevresindeki hücreler mikroskop altında temizlenerek olgunlukları kontrol edilir. Genel dünya istatistiklerine göre toplanan yumurtaların %70-75 ‘inin matür(olgun) olması gerekmektedir. Sadece olgun yumurtalara işlem yapılmalıdır.
-Oositler çevrelerindeki hücreler temizlendikten sonra 1-2 saat kadar daha 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir ve mikroenjeksiyon işlemi yapılır. Mikroenjeksiyonun tüp bebek uygulamasından en belirgin farkı mikroskop altında özel mikromanüplatörler aracılığıyla tek bir spermin tek bir oosit içerisine mekanik olarak yerleştirilmesidir. Daha sonraki döllenme ve embriyo gelişim aşamaları benzer şekilde ilerler.
-Döllenmeden sonraki 24 saat içinde yumurtalar 2-4 hücreli aşamaya, 72. saatte 6-8 hücreli aşamaya, 96. saatte morula adı verilen çok hücreli aşamaya ve 5-6.günlere gelindiğinde ise embriyonun rahme tutunmadan önceki son aşaması olan blastokist aşamasına ulaşabilirler. Döllenmiş yumurtalar 24. saatte bölünme aşamasına geçişinden itibaren morfolojik yapıları mikroskopla incelenerek kalitelerine göre gruplara ayrılır. Bu sınıflandırmada embriyonun o günkü olması gereken hücre aşaması(klivaj hızı), hücrelerin birbirine olan eşitliği, fragmantasyon adı verilen embriyo ileri gelişimini olumsuz şekilde etkilediği gösterilmiş hücre içi atipik yapıların embriyo içerisinde bulunma yüzdesi, hücre içi görünümünün parlaklığı ve homojenliği gibi özellikler incelenir. Bu değerlendirmelere göre en iyi kalitedeki embriyolar o günkü olması gereken bölünme aşamasına ulaşabilmiş, hücre büyüklükleri birbirine eşit ve homojen görünümlü,hiç fragmantasyon barındırmayan embriyolardır.(G1 embriyo)G2 embriyo:G1′den farklı olarak %20′nin altında fragmantasyon içeren;G3 embriyo hücreleri birbirilerine eşit olmayan %20-50 fragmantasyon içeren ;G4 embriyo ise hücreleri eşit olmayan %50′nin üzerinde fragmantasyon içeren embriyolardır.Yapılan çalışmalar G1-G2 embriyoların transferi ile bu embriyoların gelişim potansiyellerinin daha yüksek olmasına bağlı olarak gebelik oluşma ihtimalinin G3-G4 embriyoların transferine göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bununla beraber G1 ve G2 arasındaki oranla G3 ve G4 arasındaki oranlar benzerdir. Embriyolar blastokist aşamasına ulaştıklarında kendi aralarında kalitelerine göre tekrar sınıflandırılır. Bu sınıflandırmada blastokistin gelişim hızı ve iç hücre tabakasının yapısı incelenir. Bu sınıflandırmaya göre iyi kalitedeki blastokistler BG1-BG2(BG1 ve BG2 arasındaki tek fark BG1 blastokistlerin daha hızlı gelişmesidir.); kötü kalitedeki blastokistler ise BG3 olarak adlandırılır.BG1-BG2 blastokistlerin gebelik oluşturma ihtimalleri BG3 blastokistlere göre daha yüksektir.BG1 ve BG2 arasındaki fark ise benzerdir.
-Embriyo transferi embriyo gelişiminin 2-6. günleri arasında yapılabilir. Günümüze kadar yapılan çalışmalar halen çelişkili olmakla beraber transfer gününe göre de gebelik oranları benzerdir.
Blastokist Transferi
Blastokist; döllenmiş yumurtanın ana rahmine tutunmadan önce ulaşmış olduğu son gelişim evresidir. Embriyonun çapı blastokist aşamasına ulaşırken gittikçe büyür ve dış kılıf incelir. Blastokist dış kılıfından sıyrılıp (hatched blastokist)rahmin iç tabakasına tutunur ve gebelik oluşturur. Günümüz kültür ortamlarında embriyoların ancak ortalama %45′i bu aşamaya ulaşabilmekte bu blastokistlerinde ancak %15-20′si hatched aşamaya kadar gelişimini sürdürebilmektedir. Bu oranlar bölünme safhasındaki embriyolar kötü kalitede olduğunda daha da düşmektedir. Bu sebeplerden ötürü blastokist transferi günümüz şartlarında ancak selektif hasta gruplarında uygulanması durumunda gebelik ihtimalini arttırabilmektedir.(En fazla kabul gören endikasyonlar: En az iki başarısız IVF-ICSI siklusu olan ve embriyo gelişiminin son aşamaya kadar daha dikkatli gözlemlenmesi gereken hastalar, çoğul gebelik riski yüksek, genç ve fazla sayıda embriyosu olup gelişim potansiyeli yüksek embriyoların(blastokist)seçilebilip daha az sayıda embriyo transferi gerektiren hastalar)
Embriyo Dondurma
Embriyoların koruyucu kültür solüsyonları (krioprotektanlar)içerisinde dengelendikten sonra özel bir alet ile kademeli şekilde soğutularak dondurulması ve sıvı nitrojen (-196C)içerisinde depolanması işlemlerini içerir. Embriyo kalitesine ve hastanın yaşına bağlı olarak transfer edilecek embriyo sayısı 2-4 arasında değişebilir. Hastanın transferden sonra(yada olumsuz klinik bulgulardan dolayı o siklusta hiç transfer yapılmadan) iyi kalitede daha fazla sayıda embriyolarının bulunması halinde tekrarlayan siklusta transfer edilmek üzere bu embriyolar dondurulabilir. En iyi kalitede embriyolar dondurma işleminden minimal zarar göreceğinden (Dondurma çözme sonrasında embriyolarda canlılık oranı;%75-%90)sadece iyi kalitede embriyolar dondurulur. Kötü kalitedeki embriyoların dondurulması halinde yaşama olasılıkları oldukça düşüktür.(%20-%25)Dondurma işlemi transfer edilecek embriyoların seçiminden sonra 2-6. Gün arasında yapılabildiği gibi döllenmenin gerçekleştiği gün de yapılabilir. Dünya istatistiklerine göre dondurulmuş embriyoların çözme sonrası transferi ile gebelik oranları %25-50 arasında değişmektedir. Bu oranlar klinik ve laboratuvar prosedürlerine, hastanın yaşına, infertilite sebebine, çözülen embriyo başına canlılık oranına göre de değişkenlik göstermektedir.
Testis Biopsisi
-Ejekülatında hiçbir sperm hücresine rastlanmamış(Azospermi) yada ejekülat spermlerinin hepsi yada en az %80’i ölü olan hastalarda sperm hücreleri, sperm üretiminin kaynağı olan testislerde yada epididimde(kanallarda) aranır.
-Azosperminin sebebi kanallarda(epididim) tıkanıklık(obstrüktif azoospermi) ise kanallardan aspire edilen sıvının içerisinde laboratuvarda mikroskop altında spermin varlığı araştırılır. (MESA- mikroepididymal sperm aspirasyonu yada farklı bir yöntem olan PESA-perkütan epididiymal sperm aspirasyonu) Kanallarda da sperm hücresine rastlanmazsa testis biyopsisine geçilir.
-PESA/MESA’da sperm bulunamayan olgularda yada azoospermi sebebi direkt olarak testis(yumurtalık)teki üretim bozukluğuna bağlı olan hastalarda(non-obstrüktif azoospermi)sperm hücresinin varlığı kanallardan alınan sıvı(epididim) yerine testisten parça alınarak araştırılır.
-Testis biopsisinde alınan doku parçası laboratuvarda mikroskop altında incelenir.
-Doku parçası alınmış ise parça laboratuvarda tamamıyla ayrıştırılarak olası sperm hücrelerinin açığa çıkması sağlanır.
-İnceleme bitiminde örnek yıkama işlemine alınır. Bu işlem iki aşamadan oluşup sperm sayısına göre 35-45dk. arasında sürebilir.
-Testis biopsisi işlemi eşin yumurtalarının toplandığı gün yapılabileceği gibi 24 saat öncesinde de uygulanabilir. 24 saat öncesinde yapılması durumunda IVF laboratuvarında yıkanarak hazırlanan örnek 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren (amaç yapay vücut ortamı yaratmaktır) inkübatörlerde mikroenjeksiyon işlemine kadar inkübe edilebilir. Testis spermleri olgunlaşmamış hücreler olduğundan ötürü henüz hareket kabiliyeti kazanmamış olabilirler. Bu nedenle doku parçasının 24 saat önceden alınması ve yıkanan örneğin inkübatörlerde bekletilmesi sperm hareket faaliyetinin başlaması açısından da yararlı olabilir.
Assisted Hatching (Destekli Yuvalama)
Yardımcı üreme tekniklerinde kabul gören assisted hatching endikasyonları: İleri yaş (35 yaş ve üstü), en az bir kez tekrarlayan başarısız IVF-ICSI siklusu, yüksek bazal hormonal değerler, embriyo dış kılıfının normalden daha kalın olması ve kötü embriyo kalitesidir. Yöntem selektif olarak bu hastalarda uygulandığında gebelik oranlarını arttırabilir. Bu endikasyon gruplarına dahil olmayan hastalara uygulanması halinde gebelik oranları üzerinde etkisinin olmadığı yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur. Normal gelişimini tamamlayabilen bir embriyo, rahmin iç tabakasına tutunmadan önce dış kılıfından sıyrılabilmelidir.
Destekli yuvalama işleminde amaç; embriyonun dış kılıfını transfer öncesinde bir miktar inceltebilmek, böylelikle rahme tutunmasını kolaylaştırıp gebelik şansını arttırabilmektir. Bu işlem embriyo gelişiminin farklı aşamalarında uygulanabilir(2-5.gün). Yapılan bilimsel çalışmalar henüz ilk bölünme aşamasını henüz tamamlamış 2 hücreli embriyolarda assisted hatching işleminin hücre ileri gelişimini olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermiştir. Bu nedenle assisted hatching işlemi 2 hücreli embriyolara uygulanmaz. Destekli yuvalama IVF laboratuvarında farklı metodlarla uygulanabilir. Ör: lazer ışınları kullanarak, asidik solüsyonlarla eriterek yada sivri pipetler yardımıyla keserek.
Yapılan bilimsel çalışmalarda farklı yöntemlerde benzer gebelik oranları bildirilmiştir. Günümüzde laser assisted hatching yönteminin en hızlı- pratik yöntem olması ve minimal düzeyde kullanıcı tecrübesi gerektirmesi en yaygın olarak kullanılmasına sebep olmaktadır.
Comments